2月12日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊PNAS在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科盧潔研究組的合作研究成果，題為“Genetic recording of pancreatic beta cell proliferation”。該研究工作基于雙同源重組酶系統(tǒng)構(gòu)建了胰島beta細(xì)胞特異性ProTracer遺傳示蹤系統(tǒng)，可用于記錄生理穩(wěn)態(tài)及組織再生過程中的beta細(xì)胞增殖事件。相關(guān)研究成果揭示了胰腺穩(wěn)態(tài)維持、組織修復(fù)及再生過程中beta細(xì)胞的增殖動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，對(duì)于探索促進(jìn)胰島beta細(xì)胞再生的治療策略提供了重要理論依據(jù)與研究工具。

胰島beta細(xì)胞增殖是維持機(jī)體血糖代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其調(diào)控異常是糖尿病發(fā)生的核心機(jī)制之一。學(xué)界雖致力于篩選促beta細(xì)胞增殖的調(diào)控因子，但現(xiàn)有技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)beta細(xì)胞增殖的長(zhǎng)期追蹤。傳統(tǒng)檢測(cè)方法如Ki67、pHH3免疫染色存在固有局限，Ki67-CreER遺傳示蹤僅能獲取單時(shí)間點(diǎn)靜態(tài)數(shù)據(jù)，無法捕捉長(zhǎng)期增殖動(dòng)態(tài)。因此，開發(fā)可靠靈敏的長(zhǎng)期追蹤工具，對(duì)闡明胰島beta細(xì)胞增殖機(jī)制、研發(fā)糖尿病靶向療法至關(guān)重要。

在該項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)首先利用通用型ProTracer遺傳記錄系統(tǒng)（R26-DreER;Ki67-CrexER;R26-RSR-LSL-tdT）研究胰島細(xì)胞增殖。該系統(tǒng)基于Cre與Dre雙重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)，經(jīng)他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)后，DreER進(jìn)入細(xì)胞核切割Ki67-CrexER (Ki67-Cre-rox-ER-rox)等位基因中rox序列側(cè)翼的ER片段，使CrexER轉(zhuǎn)化為組成型激活Cre；隨后Dre與Cre共同作用于報(bào)告基因，激活系統(tǒng)。理論上，單次Tam給藥即可使該系統(tǒng)在小鼠整個(gè)生命周期內(nèi)持續(xù)、無縫地捕捉并標(biāo)記體內(nèi)發(fā)生增殖的細(xì)胞。研究人員對(duì)成年P(guān)roTracer小鼠進(jìn)行Tam處理，并分別在給藥后4周、8周及12周收集胰腺組織，觀察到tdT?陽(yáng)性beta細(xì)胞比例隨時(shí)間推移呈遞增趨勢(shì)，同時(shí)拓展分析至胰島alpha、delta、PP細(xì)胞等其他內(nèi)分泌細(xì)胞，均檢測(cè)到tdT陽(yáng)性細(xì)胞比例的時(shí)間依賴性上升。

通用型ProTracer系統(tǒng)雖能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞增殖的長(zhǎng)期追蹤，但不具備細(xì)胞類型特異性。因此，研究人員開發(fā)了beta細(xì)胞特異性ProTracer系統(tǒng)。該系統(tǒng)由Ins2-DreER、Ki67-CrexER及R26-RSR-LSL-tdT三種品系雜交構(gòu)建。DreER-rox重組可特異性激活beta細(xì)胞中的Ki67-Cre基因型，僅在Ins?Ki67?雙陽(yáng)性細(xì)胞中表達(dá)tdT，實(shí)現(xiàn)beta細(xì)胞增殖過程的特異性示蹤。研究人員對(duì)成年beta細(xì)胞-ProTracer小鼠進(jìn)行Tam處理，不同時(shí)間點(diǎn)的胰腺組織分析顯示，tdT陽(yáng)性beta細(xì)胞比例呈逐步上升趨勢(shì)。免疫染色證實(shí)絕大多數(shù)tdT陽(yáng)性細(xì)胞為beta細(xì)胞，驗(yàn)證了系統(tǒng)的高特異性。團(tuán)隊(duì)還基于細(xì)胞周期基因Ccna2構(gòu)建了替代版本系統(tǒng)，檢測(cè)數(shù)據(jù)與Ki67系統(tǒng)高度相似，進(jìn)一步精準(zhǔn)量化了成年小鼠穩(wěn)態(tài)下beta細(xì)胞增殖速率。

為了探究增殖性beta細(xì)胞的分子特性及其潛在異質(zhì)性，研究團(tuán)隊(duì)從beta細(xì)胞特異性ProTracer小鼠體內(nèi)分離胰島細(xì)胞并進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）分析。聚類分析顯示beta細(xì)胞可分為4個(gè)具有不同轉(zhuǎn)錄特征的亞群，而tdT轉(zhuǎn)錄本在4個(gè)beta細(xì)胞亞群中呈均勻分布，提示增殖性beta細(xì)胞并不構(gòu)成獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄特征亞群。GO富集分析顯示tdT?細(xì)胞上調(diào)基因主要富集于核糖體生物發(fā)生及翻譯相關(guān)功能條目。tdT⁺ beta細(xì)胞中顯著上調(diào)的基因數(shù)量有限，這種微弱的轉(zhuǎn)錄差異與ProTracer系統(tǒng)的累積性記錄特性相符：該系統(tǒng)標(biāo)記的是整個(gè)示蹤窗口內(nèi)所有發(fā)生過增殖的細(xì)胞，而非僅在檢測(cè)時(shí)處于活躍分裂狀態(tài)的細(xì)胞。提示大多數(shù)增殖后的beta細(xì)胞在組織收集時(shí)其轉(zhuǎn)錄狀態(tài)已恢復(fù)至與非增殖beta細(xì)胞相似的水平。此外，研究團(tuán)隊(duì)采用克隆分析方法（Ins2-DreER;Ki67-CrexER;R26-Confetti）對(duì)增殖性beta細(xì)胞進(jìn)行研究，低劑量Tam處理后經(jīng)一段時(shí)間觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞克隆由單個(gè)細(xì)胞或成對(duì)細(xì)胞組成，并未觀察到由大量beta細(xì)胞構(gòu)成的克隆群，提示在示蹤周期內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞周期的beta細(xì)胞其后續(xù)增殖輸出能力不存在顯著異質(zhì)性。

為驗(yàn)證系統(tǒng)在損傷修復(fù)模型中的作用，團(tuán)隊(duì)對(duì)beta細(xì)胞-ProTracer小鼠實(shí)施胰腺部分切除術(shù)（PPX），與對(duì)照組小鼠相比，PPX組小鼠的tdT熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，表明該系統(tǒng)能夠有效捕捉PPX引發(fā)的beta細(xì)胞增殖增強(qiáng)效應(yīng)。藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，Tam處理后經(jīng)一段時(shí)間洗脫期，對(duì)小鼠每日腹腔注射哈馬靈（DYRK1A抑制劑）與GW788388（TGFbeta超家族抑制劑）聯(lián)用藥物，結(jié)果顯示處理組tdT陽(yáng)性beta細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，證實(shí)該系統(tǒng)可準(zhǔn)確檢測(cè)藥物誘導(dǎo)的增殖變化，具備藥物篩選潛力。針對(duì)胰腺導(dǎo)管結(jié)扎術(shù)（PDL）對(duì)beta細(xì)胞增殖的影響爭(zhēng)議，團(tuán)隊(duì)對(duì)小鼠實(shí)施PDL后，對(duì)比損傷尾部與對(duì)照頭部的tdT陽(yáng)性beta細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)無顯著差異，表明PDL未明顯促進(jìn)beta細(xì)胞增殖。

總體而言，本研究基于雙重組酶系統(tǒng)構(gòu)建了beta細(xì)胞-ProTracer遺傳示蹤系統(tǒng)，可用于記錄生理穩(wěn)態(tài)及組織再生過程中的beta細(xì)胞增殖事件。本研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)條件下，beta細(xì)胞增殖事件隨時(shí)間推移逐漸增多，并且增殖性beta細(xì)胞的增殖潛能具有均一性。本研究通過PPX與藥物刺激兩種方式驗(yàn)證了ProTracer系統(tǒng)在beta細(xì)胞增殖監(jiān)測(cè)中的功能應(yīng)用，證實(shí)了該系統(tǒng)在量化beta細(xì)胞增殖水平方面的有效性，同時(shí)明確PDL對(duì)beta細(xì)胞增殖并無顯著促進(jìn)作用。該系統(tǒng)為beta細(xì)胞增殖研究提供了重要工具，有望推動(dòng)胰腺再生及糖尿病治療策略的發(fā)展。

分子細(xì)胞卓越中心副研究員趙歡、博士生陳惠和國(guó)科大杭州高等研究院博士后康志鑫為該論文共同第一作者。分子細(xì)胞卓越中心周斌研究員和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院盧潔教授為該論文共同通訊作者。該研究得到分子細(xì)胞卓越中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)、細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)和南模生物的大力支持和幫助。該工作得到中國(guó)科學(xué)院、基金委、科技部、上海市科委、新基石科學(xué)基金會(huì)和賽諾菲優(yōu)秀青年人才獎(jiǎng)勵(lì)基金等支持。

文章鏈接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2507877123

通用型ProTracer與beta細(xì)胞-ProTracer遺傳示蹤系統(tǒng)的建立